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      PCR實驗出現凝膠涂布貨片狀條帶彌散的原因

      發布時間: 2023-06-13  點擊次數: 2144次

      PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR),一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的大特點,是能將微量的DNA大幅增加。PCR的原理:PCR的基本過程類似于DNA的天然復制,特異性依賴于與靶序列兩端互補的Oligo引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應步驟構成。

      PCR實驗中擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下:

      (1)酶量過高。減少酶量;酶的質量差,調換另一來源的酶。

      (2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

      (3)MgCl2濃度過高??蛇m當降低其用量。

      (4)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng。

      (5)引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。

      (6)循環次數過多;增加模板量減少循環次數至30,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環。

      (7)退火溫度過低。

      (8)電泳體系有問題:

      ①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;

      ②凝膠沒有凝固好;

      ③瓊脂糖質量差。

      (9)若為PCR試劑盒則可能:

      ①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效;

      ②試劑盒本身質量有問題,如引物選擇、循環參數等選擇不當。

      (10)降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。

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